Trenntechniken: Chromatographie PMC

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Es wird davon ausgegangen, dass K unabhängig von der Konzentration ist und sich ändern kann, wenn die experimentellen Bedingungen geändert werden, beispielsweise wenn die Temperatur erhöht oder verringert wird. Für eine Säule mit fester Länge und Durchfluss können die Retentionszeit (tR) und das Retentionsvolumen (Vr) gemessen und zur Berechnung von K verwendet werden. Die Chromatographie basiert auf dem Konzept der Trennung von Molekülen in einem Gemisch, das beim Transport mit Hilfe einer mobilen Phase dem Grundzustand oder dem festen und flüssigen stationären Zustand (stabile Phase) zugesetzt wird. Hier bringen wir die zu trennende Mischung an der Unterseite des Chromatographiepapiers an und wenn das Lösungsmittel auf dem Papier aufsteigt, werden die Komponenten je nach ihrer Retention auf dem Papier unterschiedlich stark transportiert.

Das Zielmolekül bindet an den Liganden, Primesep während die anderen Moleküle in der Probenlösung die Säule passieren und kaum oder gar nicht zurückgehalten werden. Anschließend wird das Zielmolekül mit einem geeigneten Elutionspuffer von der Säule eluiert. Die Größenausschlusschromatographie (SEC)[23] trennt Polymermoleküle und Biomoleküle anhand von Unterschieden in ihrer Molekülgröße (tatsächlich anhand des Stokes-Radius eines Partikels).

  • Das Papier wird in ein Gefäß mit einer dünnen Schicht Lösungsmittel gegeben und verschlossen.
  • Zu den verschiedenen HPLC-Typen gehören Normalphasen-HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Ionenaustausch-HPLC und Größenausschluss-HPLC.
  • Solche Verbindungen sollten in reiner Form verfügbar sein und eine chemische Identität aufweisen, die der Identität des zu bestimmenden Analyten entspricht oder dieser nahe kommt.
  • In dieser Analogie stellen die Bienen und Wespen die zu trennenden Analyten dar, die Blumen stellen die stationäre Phase dar und die mobile Phase könnte man sich als Luft vorstellen.

Aufgrund seiner Vielseitigkeit decken die Anwendungen das gesamte Spektrum chemischer Verbindungen mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Siedebereich, Molekulargewicht, Flüchtigkeit und thermische Stabilität ab. Seit ihrer Entwicklung hat die Chromatographie breite Anwendung bei der Trennung von Bestandteilen von Gemischen gefunden, die von einfachsten Gasen bis hin zu komplexesten Kohlenwasserstoffgemischen reichen, die Hunderte verschiedener Verbindungen enthalten. Proben können gasförmig, flüssig oder sogar fest sein und sind in geeigneten Lösungsmitteln gut löslich. Die Chromatographie ist als Trenntechnik beispiellos und findet sogar in der Erdölindustrie Anwendung. In dieser Branche wird es zur Analyse der komplexen Kohlenwasserstoffgemische im Erdöl verwendet.

Chromatographie-Meisterklasse IV: Nachweismethoden

Solche Detektoren werden im Vergleich zu selektiven oder spezifischen Detektoren als Bulk-Property-Detektoren bezeichnet. Die Papierchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Trennung auf einem Spezialpapier durchgeführt wird. Die Reduzierung nachgelagerter Engpässe bei gleichzeitiger Steigerung der Produktivität und Flexibilität sind wesentliche Treiber für die Prozessintensivierung.

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Partikelgröße

Proteine ​​werden von der Säule getrennt, indem entweder der pH-Wert, die Konzentration der Ionensalze oder die Ionenstärke der Pufferlösung geändert werden [8]. Positiv geladene Ionenaustauschermatrizen werden Anionenaustauschermatrizen genannt und adsorbieren negativ geladene Proteine. Während mit negativ geladenen Gruppen gebundene Matrizen als Kationenaustauschmatrizen bekannt sind und positiv geladene Proteine ​​adsorbieren (Abbildung 2) [9]. Die verschiedenen Komponenten der Mischung durchlaufen die stationäre Phase mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, wodurch sie sich voneinander trennen. Die Art und Auswahl spezifischer mobiler und stationärer Phasen bestimmt, welche Stoffe sich schneller oder langsamer bewegen und wie sie getrennt werden. Die relative „Geschwindigkeit“, mit der Komponenten ein chromatographisches System durchlaufen, wird als Retentionszeit bezeichnet.

Ein Gaschromatograph besteht aus einer Probeninjektionseinheit, einer Säule und einem Detektor. Die zu analysierende Probe wird in das Probeninjektionssystem injiziert, das die Probe erhitzt und verdampft. Nachdem sich die Probe erwärmt hat, bewegt sie sich zusammen mit der gasförmigen mobilen Phase nach oben durch die Säule, die durch die stationäre Phase getrennt ist, und die endgültige Verbindung wird vom Detektor analysiert.

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist eine weit verbreitete Labortechnik und ähnelt der Papierchromatographie. Anstelle einer stationären Phase aus Papier handelt es sich jedoch um eine stationäre Phase aus einer dünnen Adsorptionsmittelschicht wie Kieselgel, Aluminiumoxid oder Zellulose auf einem flachen, inerten Substrat. Im Vergleich zu Papier bietet es den Vorteil schnellerer Durchläufe, besserer Trennungen und der Wahl zwischen verschiedenen Adsorptionsmitteln. Verschiedene Verbindungen in der Probenmischung legen unterschiedliche Distanzen zurück, je nachdem, wie stark sie mit dem Adsorbens interagieren. Dies ermöglicht die Berechnung eines Rf-Werts und kann mit Standardverbindungen verglichen werden, um die Identifizierung einer unbekannten Substanz zu erleichtern.

Die Lösung des zu trennenden Gemisches wird als kleiner Punkt im Abstand von 2 cm über einem Ende der Platte aufgetragen. Die Platte wird dann in ein geschlossenes Gefäß gegeben, das eine als Elutionsmittel bezeichnete Flüssigkeit enthält, die dann die Platte hinaufsteigt und verschiedene Komponenten der Mischung in unterschiedliche Höhen befördert. Es wird als Methode zur Bestätigung der Ergebnisse von Synthesereaktionen verwendet, da Reinheit bei dieser Art von Forschung von entscheidender Bedeutung ist. Allerdings ist die Massenspektrometrie immer noch die zuverlässigere Methode zur Artenidentifizierung.

Nach der Reinigung werden diese Markierungen normalerweise entfernt und man erhält das reine Protein. Bei der Papierchromatographie handelt es sich um eine Technik, bei der ein kleiner Punkt oder eine kleine Linie einer Probenlösung auf einen Streifen Chromatographiepapier aufgetragen wird. Das Papier wird in einen Behälter mit einer dünnen Lösungsmittelschicht gegeben und verschlossen. Während das Lösungsmittel durch das Papier aufsteigt, trifft es auf die Probenmischung, die zusammen mit dem Lösungsmittel beginnt, das Papier hinaufzuwandern. Dieses Papier besteht aus Zellulose, einer polaren Substanz, und die Verbindungen in der Mischung wandern weiter, wenn sie weniger polar sind. Polarere Stoffe verbinden sich schneller mit dem Zellulosepapier und wandern daher nicht so weit.

Beispielsweise kann die Zusammensetzung der mobilen Phase 1–3 Minuten lang konstant bei 5 % Acetonitril gehalten werden, gefolgt von einer linearen Änderung bis zu 95 % Acetonitril. Tsvet beschrieb eine Technik, die heute im Wesentlichen in der gleichen Form verwendet wird. Er füllte eine vertikale Glassäule mit einem Adsorptionsmaterial wie Aluminiumoxid, Siliciumdioxid oder Puderzucker, gab oben auf die Säule eine Lösung der Pflanzenpigmente und spülte die Pigmente mit einem organischen Lösungsmittel durch die Säule. Die Pigmente trennten sich in einer Reihe diskreter Farbbänder auf der Säule, unterteilt durch völlig pigmentfreie Bereiche. Da Tsvet mit farbigen Substanzen arbeitete, nannte er die Methode Chromatographie (von griechischen Wörtern für Farbschreiben). Tsvets Entwicklung chromatographischer Verfahren war den Chemikern in der westlichen Welt im Allgemeinen unbekannt, da er entweder in deutschen botanischen Fachzeitschriften oder in russischen Werken veröffentlichte.